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효모와 곰팡이 균체가 한 배지 내에서 생장하게 되며, 그들의
구별 방법은 아래의 전형적인 특성을 참고하여 구분한다.
[그림 1] 그림 1은 다음의 특징을 가진 효모의 예를 나타낸다. - 작고, 청초록, 외각이 명확, 중앙촛점이 없음. [그림 1] 그림 2는 다음의 특징을 가진 곰팡이 예를 나타낸다. - 크고, 다양한 색깔, 외각 불명확, 중앙촛점이 있음. |
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[그림 3] 그림 3의 실험결과는 21개의 곰팡이 균체 (크고, 초록색균체, 외각이 불분명, 중앙촛점) 와 많은 수의 효모 (추정치 = 480) 균체를 포함한다. 효모균체는 외각이 명확하며 중앙촛점이 없고, 작으며, 황갈색을 띤 균체이다. 균체수가 150개 이상일 경우, 사각형 1개(1cm²)의 평균균체수를 측정한 후, 여기에 30을 곱하면 배지당 총균수를 얻을 수 있다. (배지내의 생장지역은 30cm² 임) [그림 4] 그림 4의 실험결과는 많은 수의 효모균체를 가지고 있다. (TNTC = Too Numberous Too Count) 배지의 외각에 사각형으로 표시된 부분내의 작고 푸른 균체가 곰팡이의 TNTC와 구별을 가능케 한다. [그림 5] 때로 많은 수의 효모균체가 배지의 외각 부분에서만 푸른색의 생장을 보이는 경우가 있으며 이 결과 역시 효모의 TNTC로 기록한다. [그림 6] 배지에서 균체의 생장이 보이지 않을경우 일단 상부 필름을 들어올려 필름에 붙어있는 gel을 검사해 본다. 만약 gel에 흰색 균체들이 존재한다면 이 경우는 많은 수의 효모가 존재하는 증거이며 이 결과 역시 TNTC 로 간주된다. |
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[그림 7] 곰팡이 균체수 = 59 곰팡이 균체의 특성은 다양한 색을 가지고 확산된 외각형태를 유지하며 중앙에 촛점이 있는 것이다. 손쉬운 균체 측정을 위해 배지를 분할하고 각각의 균체를 구별하기 위하여 중앙 촛점을 찾는다. [그림 8] [그림 8]에서 다양한 색소와 희미한 가장자리가 주목된다. 이것은 많은 수의 곰팡이 균체와 발생된 포자에 의한 결과이다. 균체 측정은 중앙 촛점을 찾아서 측정하는 것이 편리하다. 제시된 사각형에는 4개의 균체가 존재한다. 모든 평판측정법 (Plate Count Methods) 처럼 균체가 밀집된 배지는 비정형적인 균체의 특성이 나타날 수 있으므로 정확한 측정을 위하여 적절한 희석이 중요하다. [그림 9,10] 같은 시료를 1:10 과 1:100 으로 희석하여 배양한 결과이다. [그림 9]는 1:10 으로 희석하여 배양한 결과로써 작고, 희미하며, 밀집된 균체들이 전형적인 생장을 저해하여 균체수 측정이 어려운 경우이다. [그림 10]은 1:100 으로 희석하여 배양한 결과로써 곰팡이는 크고, 희미한 가장자리와 중앙촛점을 가진 경우이다. |
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| 모든 생명체는 Phosphatase 효소를 가지고 있으며, 이 효소가 존재할 때 효모/곰팡이용 Petrifilm
배지의 지시약은 활성화되어 효모와 곰팡이를 푸른색으로 염색시킨다. 자연식품이나 가공식품 중 생명체를 포함하고 있는 것들은 이러한 푸른색 반응을 일으킬 수 있으며, 이들은 일정하게 푸른색의 배경색을 나타내는 경우와 강렬한 푸른색의 침점을 갖는 (향신료나 입자제품의 경우) 두가지 경우가 있다. 제품에서 효모나 곰팡이에 의하지 않고 자연적인 Phosphatase 에 의해 발생하는 색반응은 아래의 몇가지 기술적 방법들에 의해 구별되어 진다. 1) 희석 : 희석 배율을 높임으로써 푸른색의 배경이나 푸른색 침점의 수를 높일 수 있다. 2) 배지 상등액 : 시료를 혼합한 후, 푸른색 침점을 일으킬 수 있는 입자를 제거하기 위해 3~5분간 정치한 후 시료를 채취한다. 3) 배양온도 : 배지를 적정한 온도(20~25°C)에서 배양한다. 효소반응은 온도 상승에 따라 더 빠르게 진행한다. 4) 검사와 주의 : 배지의 실험결과를 24~48시간 후에 확인한다. 제품의 색변화는 24~48시간 내에 발생하며, 이 때의 반응정도는 최종 해석에 많은 참조가 된다. |
| [그림 11] 시료내에 존재하는 자연적인 Phosphatase 에 의해 발생된 일정한 배경색을 가진 배지이다. 나뭇결 모양의 외관은 희석배지에서의 제품입자 때문에 생성된다. TNTC와의 구별을 위해 배지 외각을 주시한다. |
[그림 12] 시료내에 존재하는 자연적인 Phosphatase 에 의해 발생된 푸른색 침점반응의 예로써 형태는 얇고, 침점 또는 불규칙한 모양이며 색은 짙은 파랑 또는 희미하게 보이거나 큰 입자의 외각 둘레로 얼룩이 있다. |
| [그림 13] 강한 푸른색침점의 발색반응이 생기는 또 하나의 예로써 침점은 매우 밝고, 얇고, 불규칙한 형태로 나타난다. 효모균체는 청조록 균체이며 외각이 명확하다. 곰팡이 균체는 크고, 다양한 색소를 띠며 외각이 희미하고 중앙촛점이 있다. |
[그림 14] [그림 13]과 같은 시료를 배지에 접종하기 전에 3~5분간 제품입자를 침전시킨 후에 배지에 접종한 예를 나타낸다. 아직도 제품입자에 형성된 약간의 침점지역 (사각형내) 이 있지만 제품불순물이 많이 제거된 상태이다. |
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| 배양온도와 배양시간은 제품의 오염을 일으킬 수 있는 효모와 곰팡이의 생장형태를 확인하는데 매우 중요한 요소로써
효모와 곰팡이는 일반적으로 생장이 더디며 고온에 민감하다. 효모와 곰팡이용 Pertrifilm 배지는 20~25°C 가 적당한 배양온도이며 3~5일이 적정한 배양시간이다. 곰팡이균체는 필름 사이에서 자라기 때문에 Petrifilm이 포자(Spore)를 밀어내는지 혹은 여러개의 곰팡이균체가 겹쳐서 생장하여 측정이 곤란한 경우가 있을 수도 있기 떄문에 3일째 Petrifilm을 한번 검사하는 것이 정확한 측정에 도움이 된다. 높은 온도에서 효모와 곰팡이를 배양하는 것이 빠른 실험결과를 가져 오지는 않는다. 이들은 같은 시료를 동일하게 희석한 후 다른 시간, 다른 온도에서 배양한 결과이다. 이것은 그림 15, 16 에서 강조한대로 부정적인 결과가 나올 수 있다. 그림 15, 16은 같은 시료를 동일하게 희석한 후 다른 시간, 다른 온도에서 배양한 결과이다. 결국 그림 15에서 보는 바와같이 높은 온도에서의 배양은 부정확한 결과를 가져온다. |
| [그림 15] 효모측정 = TNTC # 35°C 에서 3일간 배양한 경우 |
[그림 16] 효모측정 = TNTC (실제측정 > 10") 곰팡이 측정 = 120 (추정치) # 실온 (20~25°C)에서 5일간 배양한 경우 |
| 현미경을 통한 구분 효모와 곰팡이는 매우 다양한 종류의 미생물로써 육안으로 쉽게 구분되지 않는 경우에는, 평판배지에서와 마찬가지로 동정배양하여 현미경으로 확인해 볼 수 있다. |
